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《贵州医科大学》 2019年
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氧化苦参碱调控Keap1/Nrf2信号抑制醛固酮诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的实验研究

杨宇  
【摘要】:目的:研究氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)对醛固酮(Aldosterone,ALD)诱导体外培养SD新生大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)向肌成纤维细胞(myofibroblast)转分化模型的抑制作用,探讨其可能的作用机制。方法:采用0.08%胰酶消化出生1-2 d的SD大鼠心脏组织,经1.5 h差速贴壁后获取CFs进行原代培养,于倒置显微镜观察细胞形态。采用波形蛋白(vimentin)免疫细胞化学法鉴定CFs。采用Nrf2激动剂姜黄素(curcumin)和Nrf2 siRNA探讨OMT干预ALD诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化与Nrf2的关系。采用MTT法测定ALD诱导心肌成纤维细胞增殖的最佳浓度-效应和时间-效应,与此同时测定不同浓度的OMT、螺内酯(Spiro)和姜黄素(curcumin)对ALD诱导CFs增殖的影响;实验共分6组,对照组(Control,无血清DMEM),ALD组(ALD,0.1μmol/L),OMT低剂量组(OMT-L,OMT 18.9μmol/L+0.1μmol/L ALD),OMT高剂量组(OMT-H,OMT 37.8μmol/L+0.1μmol/L ALD),螺内酯组(Sprio1μmol/L+0.1μmol/L ALD),姜黄素组(curcumin 10μmol/L+0.1μmol/L ALD)。Nrf2 siRNA转染CFs(脂质体Lipofectamin 2000转染)实验分为空白对照组(Control,无血清DMEM),阴转对照组(negative control,NC),ALD组(ALD,0.1μmol/L),OMT-H(OMT 37.8μmol/L+0.1μmol/L ALD),转染组(Nrf2siRNA+0.1μmol/L ALD),转染+OMT-H组(Nrf2 siRNA+0.1μmol/L ALD+37.8μmol/L OMT-H)。Gimsa染色观察各组CFs形态学变化;划痕试验(scratch assay)进行细胞迁移能力分析。采用流式细胞术进行细胞周期(Cell cycle)测定。采用羟脯氨酸试剂盒测定各组细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。Western blot检测I型胶原(Collagen I)、III型胶原(Collagen III)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)、核Nrf2、浆Nrf2、浆Keap1、HO-1(Heme oxygenase-1)蛋白表达。采用免疫荧光染色法观察a-SMA蛋白的表达。RT-PCR分析Nrf2 mRNA的表达。用Nrf2 siRNA研究Nrf2在OMT处理的CFs中的作用。采用试剂盒测定谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。用荧光探针2’、7’-二氯荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平。结果:倒置显微镜下观察CFs排列紧密,呈梭形或多角形,无自发搏动;波形蛋白免疫细胞化学法鉴定显示CFs纯度大于95%;MTT法确定ALD最佳造模浓度为0.1μmol/L作用24 h;OMT-H、OMT-L、MR抑制剂螺内酯(Sprio)和Nrf2激动剂姜黄素组(curcumin)可抑制ALD所诱导的CFs增殖。Gimsa染色结果CFs的细胞核为蓝紫色,细胞浆为淡粉色。与Control组比较,ALD组细胞数量增多,细胞间隙紧密。OMT-H、OMT-L、Sprio、curcumin组与ALD组相比细胞数量减少,细胞间隙增大。划痕实验结果显示,与Control组比较,ALD组CFs的迁移能力明显提高;与ALD组比较,OMT-H、OMT-L、Sprio、curcumin组能够明显抑制ALD诱导CFs的迁移能力。细胞周期实验结果显示,与Control组比较,ALD组S期细胞分布比率显著增加;OMT-H、OMT-L、Sprio、curcumin组能够明显抑制ALD诱导S期细胞分布比率。羟脯氨酸含量测定结果显示ALD可以诱导胶原的分泌,羟脯氨酸含量升高。与ALD组比较,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组均能抑制ALD诱导的羟脯氨酸含量升高。Western Blotting实验结果显示,与Control组比较,ALD组中的collagen I、collagen III、FN、CTGF、α-SMA、MR蛋白表达上调,与ALD组相比,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组均能够抑制collagen I、collagen III、FN、CTGF、α-SMA、MR蛋白的表达;在荧光显微镜下,α-SMA的免疫荧光染色也有类似的趋势。Western Blotting实验结果显示,与Control组比较,ALD使核Nrf2、HO-1蛋白表达下调,浆Nrf2、浆Keap1的蛋白表达上调。与ALD组比较,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组中核Nrf2、HO-1蛋白表达上调,而浆Nrf2、浆Keap1的蛋白表达下调。而curcumin组和OMT+curcumin组之间核Nrf2、浆Nrf2、浆Keap1、HO-1蛋白表达无明显差异。实时荧光定量PCR(RT-PCR)结果显示ALD诱导Nrf2 mRNA表达减少,与ALD组相比,OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin组可以增加Nrf2 mRNA表达。Nrf2 siRNA转染CFs后其转染效率为60.15%;OMT显著减少ALD诱导α-SMA、collagen I、collagen III、CTGF蛋白表达增加;然而,Nrf2 siRNA逆转了OMT减少collagen I、collagen III、CTGF、α-SMA蛋白表达的作用,且Nrf2 siRNA与OMT+Nrf2 siRNA组比较无显著性差异。在荧光显微镜下,α-SMA的免疫荧光染色也有类似的趋势。荧光探针DCFH-DA检测结果显示,ALD显著增加CFs细胞中的ROS水平,如活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC),预处理OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin显著降低ALD诱导的ROS水平。不同试剂盒测定的结果显示,与Control组比较,ALD组的MDA含量显著增加,GSH含量和SOD活性显著减低;而预处理OMT-H、OMT-L、Sprio及curcumin显著降低ALD诱导MDA含量的增加,增加ALD降低的GSH水平和SOD活性;结论:OMT可以抑制ALD诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,其机制与激活Keap1/Nrf2通路有关。
【学位授予单位】:贵州医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R285.5

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