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《贵州医科大学》 2019年
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外源性H_2S对缺血再灌注后神经元线粒体损伤的影响及其相关信号通路研究

刘雨霞  
【摘要】:目的:以人神经元细胞母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞株构建氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型及二血管法(2-VO)制作血管性痴呆模型为研究对象,探讨神经元氧化应激、线粒体自噬及线粒体膜电位的变化;外源性H_2S对血管性痴呆大鼠海马神经元线粒体功能与自噬及其相关信号通路的影响。方法:体外实验:SH-SY5Y细胞构建OGD/R模型模拟脑缺血再灌注神经元损伤,共设置control(正常对照)、3/12(氧糖剥夺3h再灌注12h)、3/24(氧糖剥夺3h再灌注24h)、6/12(氧糖剥夺6h再灌注12h)、6/24(氧糖剥夺6h再灌注24h)、9/12(氧糖剥夺9h再灌注12h)、9/24(氧糖剥夺9h再灌注24h)、12/12(氧糖剥夺12h再灌注12h)、12/24(氧糖剥夺12h再灌注24h)九组,利用透射电镜观察各组细胞内自噬小体,根据电镜结果选取control、3/12、3/24、6/12、6/24五组;流式细胞仪检测线粒体膜电位及胞内活性氧(ROS)含量;蛋白免疫印迹法检测线粒体蛋白中Beclin1及P62表达情况。体内实验:改良二血管法结扎SD大鼠双侧颈总动脉制作血管性痴呆模型,按缺血进程共设置1天、7天、30天三个时间段,每个时间段各有假手术组(Sham)、模型组(VaD)、阳性对照组(Nimodipine)、NaSH低剂量组(Low-NaSH)、NaSH高剂量组(High-NaSH)五组,为保持药物处理时间一致,1天及7天阳性对照组尼莫地平术前灌胃给药30天,NaSH低剂量组、NaSH高剂量组术前NaSH灌胃给药30天,模型组和假手术组术前生理盐水灌胃30天;30天组阳性对照组术后尼莫地平灌胃给药30天、NaSH低剂量组、NaSH高剂量组术后NaSH灌胃给药30天,模型组和假手术组术后生理盐水灌胃30天。为探讨缺血再灌注损伤一段时间后是否导致大鼠认知功能障碍,利用水迷宫检测30天各组大鼠学习记忆能力。TBA法检测1天、7天、30天大鼠脑组织丙二醛(MDA)含量,WST-8法检测脑组织过氧化物歧化酶(SOD)活性,蛋白免疫印迹法检测海马神经元线粒体蛋白中Beclin1、P62表达及海马神经元胞浆中Akt、P-Akt、mTOR、P-mTOR表达情况。结果:1.OGD/R后SH-SY5Y细胞线粒体膜电位发生去极化,胞内ROS含量升高,各时间点VaD大鼠脑组织MDA含量升高,SOD酶活性升高;H_2S处理后MDA含量及SOD活性均下降。2.在OGD/R各时间段组的SH-SY5Y细胞内观察到明显的自噬小体,3/24组、6/12组、6/24组线粒体蛋白中Beclin1表达量升高,3/12组、3/24组P62表达量升高。细胞OGD/R组间比较,再灌注24h组比相应12h组线粒体ROS含量增高,Beclin1表达也更强,且6/24组P62表达较其他组高。1天组VaD大鼠海马神经元线粒体蛋白Beclin1表达量降低,P62表达量无明显变化。7天组及30天组VaD大鼠海马神经元线粒体蛋白Beclin1表达量均升高,P62表达量也明显升高;3.30天大鼠中VaD组大鼠与Sham组比较,学习记忆能力明显受损,NaSH处理后学习记忆能力及定航能力得到改善。且NaSH处理后各天数大鼠Beclin1表达量均有不同程度降低,而NaSH处理后1天组P62无明显变化,7天组P62表达量升高,30天组表达量降低。4.1天、7天、30天组VaD大鼠海马神经元胞浆中P-Akt、P-mTOR表达量均降低,NaSH处理后,1天组大鼠P-Akt、P-mTOR表达量持续降低,且NaSH高剂量组比低剂量组活性更低;但7天、30天组大鼠P-Akt、P-mTOR表达量升高。且30天NaSH高剂量组P-Akt、P-mTOR表达量比低剂量组高。结论:缺血再灌注会导致神经细胞线粒体功能受损,且引发线粒体自噬,外源性H_2S可减轻VaD大鼠海马神经元线粒体自噬程度并且可以保护线粒体功能从而改善VaD大鼠学习记忆功能,推测其保护作用是通过上调Akt/mTOR信号通路实现的。
【学位授予单位】:贵州医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R741

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