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《贵州医科大学》 2019年
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α-硫辛酸对亚砷酸钠诱导大鼠胰岛素瘤细胞自噬性死亡的保护作用及机制研究

程勇  
【摘要】:目的:1.探讨自噬在亚砷酸钠(NaAsO_2)诱导大鼠胰岛素瘤(INS-1)细胞死亡过程中的作用及分子机制;2.探讨α-硫辛酸(α-LA)对NaAsO_2致INS-1细胞自噬性死亡过程的保护作用及分子机制。方法:1.NaAsO_2诱导INS-1细胞自噬性死亡研究实验:以INS-1细胞为研究对象,实验设空白对照(Ctrl)组,不同浓度NaAsO_2组(120、60、30、15、5μmol/L),(1)采用CCK8法检测不同浓度NaAsO_2作用INS-1细胞24 h后INS-1细胞的增殖抑制率,根据CCK8实验结果,采用NaAsO_2(30、15、5μmol/L)三个浓度为染砷浓度进行后续实验研究。(2)通过透射电子显微镜观察INS-1细胞超微结构;(3)通过激光扫描共聚焦显微镜观察转染质粒GFP-LC3后INS-1细胞内荧光的表达;(4)设空白对照组、NaAsO_2组(30、15、5μmol/L)、自噬抑制剂氯喹组(CQ,10μmol/L)、CQ与NaAsO_2合用组(CQ+NaAsO_2 30μmol/L)作用INS-1细胞24 h后采用Western-Blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表达。2.α-LA对NaAsO_2致INS-1细胞自噬性死亡过程的保护作用实验研究:以INS-1细胞为研究对象,根据实验1结果选择NaAsO_2浓度30μmol/L建立INS-1细胞自噬损伤模型,实验设空白对照组、模型组(NaAsO_2 30μmol/L)组及α-LA(200、100、50μmol/L)预处理组,预处理时间为用NaAsO_2造模前3h,按分组处理INS-1细胞24h后。(1)采用CCK8比色法检测INS-1细胞的增殖抑制率;(2)通过透射电子显微镜观察INS-1细胞超微结构;(3)通过激光扫描共聚焦显微镜观察转染质粒GFP-LC3后INS-1细胞内荧光的表达;(4)通过Western-Blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin-1、mTOR、PI3K、AKT的表达。结果:1.NaAsO_2诱导INS-1细胞自噬性死亡研究实验结果:(1)NaAsO_2能够明显抑制INS-1细胞的增殖,经NaAsO_2作用24 h后的IC50为23.28μmol/L。(2)通过透射电镜观察NaAsO_2组INS-1细胞中可见双层膜自噬小体与自噬空泡生成。(3)转染质粒GFP-LC3后NaAsO_2组激光扫描共聚焦显微镜下可见INS-1细胞中绿色点状荧光聚集增多。(4)Western-Blot检测结果表明与空白对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.89±0.04)、P62(0.50±0.04)、Beclin-1(2.00±0.09)、mTOR(1.48±0.04)、PI3K(1.41±0.02)、AKT(1.38±0.04)比较,30、15、5μmol/L Na As O2组INS-1细胞中LC-3Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达分别为(1.36±0.02、1.12±0.02、1.09±0.04)增多,P62蛋白表达分别为(2.78±0.03、2.71±0.06、1.14±0.11)增多,Beclin-1蛋白表达分别为(1.36±0.07、1.47±0.05、1.87±0.06)减少,m TOR蛋白表达分别为(0.69±0.04、0.82±0.02、0.89±0.08)减少,PI3K蛋白表达分别为(0.61±0.04、0.70±0.03、0.89±0.05)减少,AKT蛋白表达分别为(0.94±0.01、1.43±0.06、1.43±0.04)减少,除Na As O2 5μmol/L组LC3、Beclin-1蛋白及15、5μmol/L组AKT蛋白表达无统计学差异外,其余差异均具有统计学意义(P0.05);与空白对照组比较10μmol/L CQ处理组INS-1细胞中P62蛋白表达(0.96±0.06)增多,差异具有统计学意义(P0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达(1.03±0.07),Beclin-1蛋白表达(2.17±0.08),m TOR蛋白表达(1.14±0.09),PI3K蛋白表达(1.39±0.06,AKT蛋白表达(1.36±0.04),均无统计学差异。与30μmol/L Na As O2组比较,CQ与Na As O2合用组INS-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达[(1.22±0.02)]减少,P62蛋白表达(3.00±0.02)增多,Beclin-1蛋白表达(1.74±0.01)增多,m TOR蛋白表达(1.07±0.04)增多,PI3K蛋白表达(1.08±0.06)减少,AKT蛋白表达(1.16±0.05)增多,差异均具有统计学意义(P0.05)。2.α-LA对Na As O2诱导INS-1细胞自噬性死亡过程的保护作用实验研究(1)经Na As O2作用后,INS-1细胞增殖抑制率明显上升,细胞活性降低;给予α-LA预处理后INS-1细胞增殖抑制率下降,细胞活性增加。(2)透射电镜下Na As O2组INS-1细胞中可见明显双层膜自噬小体与自噬空泡生成,α-LA各预处理组INS-1细胞中未见明显自噬小体和自噬空泡生成。(3)转染质粒GFP-LC3后,激光扫描共聚焦显微镜下Na As O2组可见明显绿色点状荧光斑点聚集,α-LA各预处理组未见明显荧光斑点聚集。(4)Western-Blot检测结果表明:与空白对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(2.10±0.10)、P62(0.26±0.05)、Beclin-1(1.35±0.05)、m TOR(1.12±0.07)、PI3K[(0.88±0.05)、AKT(0.97±0.05)比较,30μmol/L Na As O2组INS-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达(3.94±0.14)增多,P62蛋白表达(0.97±0.03)增多,Beclin-1蛋白表达(1.02±0.02)减少,m TOR蛋白表达(0.77±0.03)减少,PI3K蛋白表达(0.54±0.02)减少,AKT蛋白表达(0.68±0.01)减少,差异均有统计学意义(P0.05);与30μmol/L Na As O2组比较,200、100、50μmol/Lα-LA预处理组INS-1细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达分别为(1.77±0.12、2.65±0.08、2.63±0.15)减少,P62蛋白表达分别为(0.64±0.03、0.61±0.03、0.68±0.02)减少,Beclin-1蛋白表达分别为(1.25±0.04、1.26±0.04、1.08±0.02)增多,m TOR蛋白表达分别为(1.15±0.08、1.39±0.05、0.90±0.01)增多,PI3K蛋白表达分别为(0.89±0.07、0.79±0.05、0.59±0.03)增多,AKT蛋白表达分别为(1.18±0.05、1.16±0.03、0.79±0.01)增多,除50μmol/Lα-LA预处理组Beclin-1蛋白表达无统计学意义外,其余差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:1.Na As O2可诱导INS-1细胞自噬性死亡,其机制可能与调控PI3K/AKT-m TOR信号通路有关。2.α-LA可能通过介导PI3K/AKT-m TOR信号通路对Na As O2诱导的INS-1细胞自噬性死亡发挥保护作用。
【学位授予单位】:贵州医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R965

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