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《贵州医科大学》 2019年
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MMP-2重组真核表达载体的构建及其在肝癌SMMC-7721细胞中的作用

夏庆  
【摘要】:目的:构建人MMP-2重组真核表达载体,观察其表达蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响,并对上述作用机制进行探讨。方法:以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型,基因重组技术构建重组真核表达载体pEYFP-MMP-2,质粒转染使模型细胞表达MMP-2融合蛋白(MMP-2-YFP),RNAi抑制模型细胞内源性MMP-2表达,设立空白对照(Control)、MMP-2沉默对照组(siCON)、MMP-2沉默组(siMMP-2)、MMP-2融合蛋白对照组(ovNC)、MMP-2融合蛋白组(ovMMP-2),划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭小室实验检测细胞侵袭能力,Calpain特异性抑制剂calpeptin抑制Calpain活性,蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2融合蛋白、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达变化。结果:(1)构建MMP-2真核表达载体pEYFP-MMP-2,并在模型细胞中高表达MMP-2融合蛋白。(2)MMP-2 siRNA显著抑制模型细胞内源性MMP-2表达(p0.01)。(3)与siCON相比,siMMP-2组12h、24h及48h迁移率明显降低,且48h侵袭率明显降低(p0.01);与ovNC组相比,ovMMP-2组12h、24h及48h迁移率明显增强,且48h侵袭率明显升高(p0.05)。(4)与siCON组相比,siMMP-2组E-cadherin蛋白表达明显上调,N-cadherin及Vimentin蛋白表达明显下调(p0.01);与ovNC组相比,ovMMP-2组细胞E-cadherin蛋白表达明显下调,N-cadherin及Vimentin蛋白表达明显上调(p0.01)。(5)Calpeptin处理可以显著降低ovMMP-2组的细胞迁移率和侵袭率(p0.01)(6)Calpeptin处理明显上调ovMMP-2组细胞内E-cadherin蛋白表达,并下调N-cadherin和Vimentin(p0.01)蛋白表达。结论:成功构建MMP-2真核表达载体pEYFP-MMP-2,并在肝癌细胞中高表达MMP-2融合蛋白;MMP-2融合蛋白可通过Calpain介导肝癌细胞的迁移、侵袭及EMT。
【学位授予单位】:贵州医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.7

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