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《贵州医科大学》 2019年
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视蛋白3在紫外线A诱导光老化中的作用及机制研究

兰应华  
【摘要】:目的:检测视蛋白(opsins,OPNs)是否在人皮肤成纤维细胞中表达,进一步探索OPNs是否参与调控紫外线A(UVA)诱导的光老化形成,并明确其分子调控机制。方法:贴壁法分离培养人原代皮肤成纤维细胞,传至第3代,利用形态学观察、特异性波形蛋白荧光染色鉴定后进行后续实验。免疫荧光检测OPNs在成纤维细胞中的表达及定位;实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测OPNs的核酸水平;蛋白质印迹法(Western-blot)在蛋白水平上验证OPNs的表达。不同剂量UVA照射人皮肤成纤维细胞后,形态学观察细胞状态,并利用CCK8检测细胞存活率,Western-blot检测照射后OPNs的表达变化;根据CCK8及OPNs表达变化的结果,以10J/cm~2 UVA反复照射人皮肤成纤维细胞,构建成纤维细胞光老化模型;通过形态学、细胞周期及β半乳糖苷酶染色确定光老化模型建立成功。利用Western-blot检测OPN3、基质金属蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1,MMP1)及基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3,MMP3)在光老化模型中表达情况;免疫荧光检测OPN3分别与MMP1、MMP3在成纤维细胞上的共表达定位。接下来,利用RT-PCR和Western-blot检测siRNA靶向沉默OPN3的效率。siRNA靶向成功沉默OPN3后,再予UVA照射,Western-blot检测MMP1及MMP3的表达变化。另外分别UVA照射细胞、siRNA靶向沉默细胞OPN3后再予UVA照射及使用PLC抑制剂U73122处理细胞后再予UVA照射,利用Fluo-3-AM探针处理后,免疫荧光和流式细胞术检测胞内Ca~(2+)浓度;Western-blot检测MAPK/AP-1信号通路相关蛋白表达。结果:相差显微镜下可见成纤维细胞呈长梭形生长,免疫荧光染色波形蛋白阳性。免疫荧光显示视蛋白亚单位(OPN1-SW,OPN2,OPN3,OPN4,OPN5)以半圆或圆的形式排列在成纤维细胞膜上的表达,并且OPN3的免疫荧光强度显著高于其他视蛋白。通过Western-blot和RT-PCR分别分析视蛋白的蛋白表达水平和mRNA水平,结果与免疫荧光的结果一致(p0.05)。5J/cm~2至25J/cm~2 UVA单一剂量照射成纤维细胞后检测了OPN3的蛋白表达水平,在5J/cm~2的剂量下增加,在10J/cm~2达到峰值,然后逐渐下降。同时用CCK-8测定法测试不同剂量的UVA照射成纤维细胞后的细胞增殖情况。在10J/cm~2 UVA照射后,超过75%的细胞保持活力。结合以前的文献报道,我们选择10J/cm~2 UVA进行后续研究。单次剂量10J/cm~2 UVA照射后OPN3的表达显着高于其他OPN的蛋白表达水平。在光老化模型中的OPN3蛋白表达水平也显著高于对照组(p0.01)。另外,光老化模型中的MMP1、MMP3蛋白表达水平也显著高于对照组(p0.01)。我们进一步探讨OPN3和MMP1、MMP3的相关性;免疫荧光染色证实了OPN3分别与MMP1和MMP3在成纤维细胞中共表达。Western-blot对沉默OPN3前后的成纤维细胞内诱导光老化相关的基因进行检测,结果发现UVA照射靶向沉默OPN3的成纤维细胞后,MMP1和MMP3在蛋白水平的表达无明显变化。我们进一步研究该机制,根据先前的研究表明G蛋白偶联受体(GPCRs)的激活导致钙通量的增加。在本实验中,UVA照射成纤维细胞后,用Fluo-3AM探针测量细胞内钙水平,免疫荧光和流式细胞术结果为细胞内钙水平显著增加,以及相关p-CAMKⅡ、p-CREB蛋白表达水平也显著增加。另外,UVA照射靶向沉默OPN3的成纤维细胞后,细胞内钙水平及相关p-CAMKⅡ、p-CREB蛋白表达水平无明显变化。为了弄清楚OPN3是通过何种信号通路对MMP1和MMP3的表达进行调控,我们进一步采用Ca~(2+)信号通路抑制剂(PLC抑制剂U73122)处理成纤维细胞,然后在蛋白水平检测MMP1和MMP3表达;结果显示:抑制PLC通路可以降低MMP1和MMP3表达;同时抑制PLC通路再行UVA照射后,MMP1和MMP3蛋白表达水平无明显变化。以前的研究表明下游的p38MAPK、ERK、JNK信号转导通路参与MMPs的调控。我们使用siRNA沉默成纤维细胞中OPN3表达后再行UVA照射,结果显示p38MAPK、ERK及JNK信号转导通路的相关蛋白表达无明显变化;而UVA激活OPN3后,p38MAPK、ERK及JNK信号转导通路的相关蛋白表达上调,从而触发MMP1和MMP3高表达降解胶原纤维导致光老化。结论:我们的研究表明UVA通过OPN3-钙依赖信号转导通路及下游MAPK/AP-1信号相关蛋白磷酸化,上调MMP1和MMP3的表达。并揭示了OPN3作为UVA关键传感器并可能用于皮肤光老化预防或临床治疗的分子靶标。
【学位授予单位】:贵州医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R758.1

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